Et spesialtog som kjører fra Antarktis til jungelen kan slutte å eksistere, og årsaken skyldes forringelsen av jernbanesporene. Dyrene, redde for å miste den eneste transporten som lar dem reise, henvendte seg til Diego for å få hjelp på Go Diego Go! Diego's Railroad Rescue. Gutten er klar til å hjelpe, og involverer deg i gjennomføringen av planen hans. Det innebærer å reparere veien, men først må du sette alle dyrene i vognene. Passasjerer går med på å reise kun i selskap med sitt eget slag, så det er en egen vogn for pingviner, hjort, bjørn og så videre. Når alle dyrene er plassert, vil toget begynne reisen, og før hvert stopp må du sette sammen veien som et puslespill ved å snu individuelle seksjoner i Go Diego Go! Diego's Railroad Rescue.
